2017年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予雅克·杜邦內(nèi)特（Jacques Dubochet），約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他們“在開發(fā)用于溶液中生物分子高分辨率結(jié)構(gòu)測(cè)定的冷凍電鏡技術(shù)方面的貢獻(xiàn)”。這是一種呈現(xiàn)生物分子三維立體圖像的技術(shù)方法。使用冷凍電鏡技術(shù)，研究人員能夠?qū)⑦\(yùn)動(dòng)中的生物分子進(jìn)行冷凍，并在原子層面上進(jìn)行高分辨率成像。這項(xiàng)技術(shù)將生物化學(xué)帶入了一個(gè)嶄新時(shí)代。2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予雅克·杜邦內(nèi)特（Jacques Dubochet），約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他們“在開發(fā)用于溶液中生物分子高分辨率結(jié)構(gòu)測(cè)定的冷凍電鏡技術(shù)方面的貢獻(xiàn)”。

圖一：過去幾年間，科學(xué)家陸續(xù)發(fā)布了多種復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合體的原子結(jié)構(gòu)。a。 一種控制晝夜節(jié)律的蛋白質(zhì)復(fù)合體。b。 一種可感知耳中壓力變化、使我們聽到聲音的感應(yīng)器。c。 寨卡病毒。

在過去的數(shù)年間，大量令人驚嘆的分子結(jié)構(gòu)充斥著各類文獻(xiàn)（如圖一）：沙門氏菌用于侵襲細(xì)胞的注射端；導(dǎo)致化療以及抗生素失效的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖；以及掌管生物晝夜節(jié)律的復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)等等。這里所展示的還只不過是冷凍電鏡技術(shù)（cryo-EM）應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)很少的案例。當(dāng)研究人員開始懷疑寨卡病毒和發(fā)生在巴西境內(nèi)導(dǎo)致大量新生兒出現(xiàn)大腦損傷的“小頭癥”有關(guān)聯(lián)時(shí)，他們利用冷凍電鏡技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行了直接成像。在短短數(shù)月內(nèi)，原子層面分辨率的寨卡病毒的立體三維圖像便產(chǎn)生出來了，科學(xué)家們基于這些成果迅速研發(fā)相應(yīng)藥物。

雅克·杜邦內(nèi)特、約阿希姆·弗蘭克以及理查德·亨德森的突破性貢獻(xiàn)讓冷凍電鏡技術(shù)得以成為現(xiàn)實(shí)。這項(xiàng)技術(shù)將生物化學(xué)技術(shù)帶入了一個(gè)嶄新的時(shí)代，讓科學(xué)家們獲取高分辨率生物分子圖像變得前所未有的容易。

圖像是知識(shí)的載體和基礎(chǔ)。在20世紀(jì)上半葉，生物分子——比如說蛋白質(zhì)，DNA以及RNA都是生物化學(xué)地圖上無法填充的空白區(qū)?？茖W(xué)家們知道這些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)扮演著關(guān)鍵性作用，但我們無從知曉這些物質(zhì)本身究竟是什么樣的結(jié)構(gòu)。直到1950年代，當(dāng)英國劍橋大學(xué)的科學(xué)家們開始探索利用X射線研究蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)時(shí)，這一問題才開始嶄露曙光——這是歷史上第一次，人類開始有可能將這些物質(zhì)繁復(fù)纏繞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)用可視化的方式呈現(xiàn)出來。

到了上世紀(jì)1980年代，X射線晶體學(xué)成像方法得到了核磁共振（NMR）技術(shù)的幫助，用于研究固體狀態(tài)或者溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)技術(shù)不僅揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，還能研究蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)及其與其他分子之間的相互作用。正是因?yàn)橛辛诉@兩種技術(shù)的幫助，我們現(xiàn)在才會(huì)有囊括了數(shù)以千計(jì)生物分子模型的數(shù)據(jù)庫可以使用，這些數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在被應(yīng)用在從基礎(chǔ)研究到制藥公司的各行各業(yè)。

然而，這兩種技術(shù)都有著基礎(chǔ)性缺陷。對(duì)溶液內(nèi)樣品使用核磁共振技術(shù)對(duì)樣品本身有限制，它只能應(yīng)用于相對(duì)較小的蛋白質(zhì)。而X射線晶體學(xué)方法要求必須首先將樣品制作為晶體，比如進(jìn)行低溫凍結(jié)。即便如此，zui終拍攝出來的圖像看上去的效果仍然就像早期相機(jī)拍出的黑白照片，科學(xué)家們很難從這些模糊不清的圖像中提取到關(guān)于蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)下的有價(jià)值信息。

另外，很多分子是很難制備成晶體樣本的，這一缺陷zui終讓理查德·亨德森在1970年代下決心放棄X射線晶體學(xué)方法——而這，正是今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)成果故事的開端。

亨德森另辟蹊徑

理查德·亨德森在英國劍橋大學(xué)獲得X射線晶體學(xué)領(lǐng)域的博士學(xué)位。他利用這種方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行成像，但是當(dāng)他嘗試對(duì)一種自然地內(nèi)嵌于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行晶體制備時(shí)，卻遭遇到巨大困難。膜蛋白難以操控。它們一旦離開原有的自然環(huán)境，也就是細(xì)胞膜之后就會(huì)萎縮成一團(tuán)毫無用處的物質(zhì)。

理查德·亨德森嘗試成像的第一種膜蛋白難以制備足夠用量的樣本，而第二種膜蛋白則難以結(jié)晶。在經(jīng)過數(shù)年的徒勞沮喪之后，亨德森開始嘗試他zui后的一種“殺手锏”——電子顯微鏡。在當(dāng)時(shí)，電子顯微鏡是否真的能夠在這一領(lǐng)域使用仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。這項(xiàng)技術(shù)被稱為透射電鏡，其原理或多或少與傳統(tǒng)的顯微鏡類似，不同的只是會(huì)有一束電子束流射向樣品，而不是傳統(tǒng)顯微鏡那樣是一束光線。

電子的波長(zhǎng)遠(yuǎn)小于光子，因此電子顯微鏡能夠分辨非常微小的結(jié)構(gòu)——甚至是單個(gè)的原子。理論上講，電子顯微鏡的分辨率要滿足亨德森拍攝膜蛋白結(jié)構(gòu)的需求是綽綽有余的，但是在現(xiàn)實(shí)中，這一目標(biāo)卻幾乎是無法實(shí)現(xiàn)的。

當(dāng)電子顯微鏡在1930年代被zui早發(fā)明出來時(shí)，科學(xué)家們認(rèn)為其只適合對(duì)“死的”物質(zhì)進(jìn)行研究。獲得高分辨率圖像所需的強(qiáng)烈電子束流會(huì)破壞生物材料樣品，而如果降低電子束流強(qiáng)度，成像質(zhì)量則會(huì)大幅下降。

除此之外，電子顯微鏡需要用到真空腔，而這也不適合應(yīng)用于生物分子，因?yàn)樵谶@樣的環(huán)境下生物分子周圍的水會(huì)迅速揮發(fā)掉。而當(dāng)生物分子干涸時(shí)，它們的結(jié)構(gòu)將崩塌，喪失自然結(jié)構(gòu)特征，從而讓成像結(jié)果變得毫無意義。所有這一切幾乎都在告訴亨德森，他的大膽嘗試注定將要失敗。但是，他的嘗試卻由于他當(dāng)時(shí)選中進(jìn)行研究的蛋白質(zhì)類型比較特殊而出現(xiàn)了轉(zhuǎn)機(jī)，他研究的對(duì)象是細(xì)菌視紫紅質(zhì)。

這樣還不夠好

細(xì)菌視紫紅質(zhì)是一種內(nèi)嵌在光合作用有機(jī)體細(xì)胞膜上的紫色蛋白質(zhì)，其能夠捕捉太陽光線中的能量。亨德森不再試圖像以前那樣將其從細(xì)胞膜上剝離，而是將其直接連同其所在的細(xì)胞膜一起放置到電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。由于該蛋白質(zhì)此時(shí)仍然處于細(xì)胞膜上的自然環(huán)境下，它繼續(xù)保持著自己的自然立體結(jié)構(gòu)。亨德森小組用葡萄糖溶液覆蓋樣本表面以防止其在真空腔內(nèi)干涸。

但是強(qiáng)大的電子束流是一個(gè)問題，不過研究組從這種蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上內(nèi)嵌方式中獲得了啟發(fā)。他們沒有采用高強(qiáng)度電子束流，而是使用了強(qiáng)度更低的束流。這樣得到的圖像對(duì)比度很差，無法分辨單個(gè)分子，但研究組利用了一個(gè)此前已知的事實(shí)，那就是這種蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上是規(guī)整排列且朝向一致的。當(dāng)所有蛋白質(zhì)都發(fā)生同向衍射時(shí)，基于衍射模式計(jì)算，研究組能夠反推得到更加精細(xì)的圖像——這種方法與在X射線晶體學(xué)成像技術(shù)中使用的數(shù)學(xué)方法是類似的。

 
圖二：圖為1975年發(fā)布的首個(gè)細(xì)菌視紫紅質(zhì)粗略模型。圖源《自然》第257期28至32頁。

下一步，研究組將細(xì)胞膜樣品再次放置到電子顯微鏡下，從很多不同的角度進(jìn)行拍攝。通過這種方法，到1975年時(shí)他們已經(jīng)能夠得到細(xì)菌視紫紅質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)圖像了（圖2）。從圖像中可以清晰觀察到蛋白質(zhì)鏈條是如何在細(xì)胞膜上來回穿行的。這是歷史上使用電子顯微鏡獲得的zui佳蛋白質(zhì)圖像。很多人對(duì)這樣的高分辨率圖像印象深刻（其圖像分辨率達(dá)到了7埃水平，相當(dāng)于0.0000007毫米）。這是一個(gè)驚人的成就，但在亨德森看來，這樣的結(jié)果還不夠好。他的目標(biāo)是達(dá)到X射線晶體學(xué)成像方法通常能夠達(dá)到的分辨率水平——大約3埃左右，并且他堅(jiān)信利用電子顯微鏡成像技術(shù)，這個(gè)目標(biāo)是可以實(shí)現(xiàn)的。

第一張?jiān)訉用娣直媛蕡D像

在接下來的數(shù)年間，電子顯微鏡技術(shù)逐漸完善。鏡片質(zhì)量得到了改善，低溫冷凍技術(shù)也有了新的進(jìn)步。在進(jìn)行觀察之前，先利用液氮對(duì)樣本進(jìn)行快速冷凍，從而避免其受到電子束流的損傷。得益于這些技術(shù)進(jìn)步，理查德·亨德森逐漸為他研究的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白圖像加入更多細(xì)節(jié)。為了獲得zui佳分辨率，亨德森遍訪世界各地zui好的電子顯微鏡設(shè)備。zui終，到了1990年，在他發(fā)表第一份細(xì)菌視紫紅質(zhì)立體模型整整15年后，亨德森達(dá)成了自己當(dāng)年許下的目標(biāo)：他對(duì)外發(fā)布了分辨率達(dá)到原子層面的細(xì)菌視紫紅質(zhì)立體圖像（圖三）。

 
圖三：1990年，亨德森發(fā)布了原子級(jí)分辨率的細(xì)菌視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)。

通過這些工作，亨德森證明了，利用冷凍電鏡技術(shù)是可以拍攝出分辨率媲美X射線晶體學(xué)傳統(tǒng)方法的圖像的。這是一項(xiàng)重要的里程碑。然而，這一成功有一個(gè)前提，那就是他選擇的蛋白質(zhì)很特殊，細(xì)菌視紫紅質(zhì)是有規(guī)則地內(nèi)嵌在細(xì)胞膜上的。但是其他蛋白質(zhì)卻并非如此。

這個(gè)問題很重要，因?yàn)樗鼪Q定了這種方法是否具有普適性，是否能夠被推廣應(yīng)用：科學(xué)家們有可能利用電子顯微鏡獲得那些分布上沒有規(guī)律的蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)圖像嗎？亨德森堅(jiān)信這個(gè)問題的答案是肯定的，而他的同行們認(rèn)為亨德森的想法太過樂觀了。

與此同時(shí)，在大西洋的彼岸，紐約州衛(wèi)生署，約阿希姆·弗蘭克也一直在思考著同樣的問題。在1975年，他發(fā)展出一種理論方法，能夠?qū)㈦娮语@微鏡獲得的二維平面模糊圖像進(jìn)行分析和疊加處理，zui終得到更高分辨率的三維立體圖像。但弗蘭克zui終花費(fèi)了超過10年時(shí)間才逐漸將這一方法一步步完善。

弗蘭克的圖像分析算法

 
圖四：弗蘭克生成三維結(jié)構(gòu)的圖像分析法

約阿希姆·弗蘭克的方法（圖四）基本原理是讓計(jì)算機(jī)去自動(dòng)分析電子顯微鏡獲得的模糊二維圖像，識(shí)別其中的蛋白質(zhì)與周遭背景。他開發(fā)出一套數(shù)學(xué)方法，能夠讓計(jì)算機(jī)識(shí)別在圖像中反復(fù)出現(xiàn)的模式。隨后計(jì)算機(jī)將相類似的圖像模式歸類到一起并將這些圖像中的信息進(jìn)行合并疊加，從而生成更加清晰的圖像。

通過這種方法，弗蘭克獲得了一系列高分辨率的二維圖像。這些圖像展示的是同一種蛋白質(zhì)，但是角度不同。整套算法軟件到1981年終于完成。下一步，弗蘭克必須弄清楚這些不同角度的二維圖像之間是如何相互關(guān)聯(lián)的，基于這些信息，他要嘗試將這些二維圖像合并并構(gòu)建三維立體圖像。弗蘭克在1980年代中期對(duì)外發(fā)布了部分他開發(fā)的圖像算法，并基于這一算法發(fā)布了核糖體的表面結(jié)構(gòu)模型，這是一種在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，主要功能是合成蛋白質(zhì)。

約阿希姆·弗蘭克的圖像處理方法對(duì)于冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展是基礎(chǔ)性的。

現(xiàn)在，讓我們把時(shí)間再回溯到1978年，此時(shí)的弗蘭克正忙于完善他的圖像處理算法軟件，而就在這一年，今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的第三位獲獎(jiǎng)人雅克·杜邦內(nèi)特被設(shè)在德國海德堡的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室錄用了。杜邦內(nèi)特將要解決的是電子顯微鏡領(lǐng)域的另外一個(gè)基礎(chǔ)性問題：當(dāng)被放置于真空腔內(nèi)時(shí)，生物樣本是如何干涸并遭到破壞的？

杜邦內(nèi)特的玻璃化方法

 
1984年杜邦內(nèi)特首次通過玻璃水方法拍攝到樣本周圍的病毒。

在1975年，亨德森使用葡萄糖來保護(hù)樣品，防止他的細(xì)胞膜樣品干涸。但這種方法不適用于水溶性的生物分子。其他研究者曾經(jīng)嘗試?yán)鋬鰳悠?，因?yàn)楸恼舭l(fā)速度要比水慢，但冰的晶體結(jié)構(gòu)會(huì)擾亂電子束流，導(dǎo)致產(chǎn)生的圖像是無效的。
水的蒸發(fā)問題讓人為難，然而雅克·杜邦內(nèi)特卻看到了一個(gè)潛在解決方案：快速冷卻水，使其在液態(tài)形式下固化，形成一種玻璃，而不是晶體。

玻璃材料是一種固體材料，但事實(shí)上卻是液體，因?yàn)樗哂谢靵y無序的分子排列。杜邦內(nèi)特意識(shí)到，如果將水變成玻璃——也叫做“玻璃水”，電子束將均勻衍射，并提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)背景。

zui初，研究小組試圖在零下196攝氏度的液氮中玻璃化微小水滴，但一直沒能成功，zui后用乙烷代替液氮后才zui終實(shí)現(xiàn)，而乙烷本身則需要先用液氮來進(jìn)行冷卻。在顯微鏡下，他們觀察到一種前所未見的情景。他們一開始認(rèn)為這應(yīng)該是乙烷，但是當(dāng)液滴經(jīng)過輕微加熱，其分子卻突然出現(xiàn)重新排列，形成了一種熟悉的晶體結(jié)構(gòu)。這是一項(xiàng)重要的成就，因?yàn)楫?dāng)時(shí)很多研究人員認(rèn)為不可能實(shí)現(xiàn)水滴的玻璃化，而現(xiàn)在我們認(rèn)為，玻璃化的水是宇宙中zui常見的水的形式。

一種簡(jiǎn)單技術(shù)提升對(duì)比度

在1982年取得技術(shù)突破之后，杜邦內(nèi)特的研究小組快速研制一種基礎(chǔ)性技術(shù)，該技術(shù)仍用于冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）。他們將生物樣本制成溶液——期初是不同類型的病毒。這些溶液涂抹在金屬網(wǎng)上形成薄膜。隨后使用一種類似彈弓的結(jié)構(gòu)將其射入液態(tài)乙烷快速冷卻，從而使薄膜水玻璃化。

1984年，杜邦內(nèi)特首次發(fā)布了不同病毒的結(jié)構(gòu)圖像，有圓形，有六邊形。這些圖像中病毒圖像均與背景玻璃水存在清晰反差。到這里為止，生物材料就比較容易通過電子顯微鏡進(jìn)行觀察了。很快，各地的科學(xué)家們便開始前往杜邦內(nèi)特的實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)這項(xiàng)zui新的技術(shù)。

從“水滴學(xué)”到大變革

冷凍電鏡zui重要的問題是拍攝圖像的質(zhì)量較低。1991年，約阿希姆？？弗蘭克使用杜邦內(nèi)特的玻璃化方法成像核糖體，并使用自己的軟件分析這些圖像，他獲得一個(gè)分辨率為40埃的三維立體圖像。

這是電子顯微鏡領(lǐng)域令人振奮的一項(xiàng)突破，但是圖像僅能顯示核糖體輪廓。坦白地講，它更像一團(tuán)色塊，分辨率上完全不能與X射線晶體學(xué)的原子級(jí)分辨率相提并論。

由于冷凍電鏡除了觀察不平整的表面之外，罕有用武之地，因此這種方法有時(shí)被嘲笑是“只能看見一坨東西的技術(shù)”（blobology）。

然而，很大程度上是由于理查德·亨德森堅(jiān)信有朝一日電子顯微鏡將能夠提供原子層面分辨率的圖像并不斷進(jìn)行著嘗試，電子顯微鏡技術(shù)經(jīng)歷著不斷進(jìn)步，它的分辨率正一埃一埃地不斷改善，zui后一個(gè)障礙在2013年被成功突破——一種全新的電子顯微鏡問世了（圖六）。
 

洞察細(xì)胞的每個(gè)隱秘角落

現(xiàn)在，夢(mèng)想已成現(xiàn)實(shí)。我們正面對(duì)生物化學(xué)領(lǐng)域的爆炸式發(fā)展。冷凍電鏡的諸多優(yōu)勢(shì)使其具有了革命性的意義：杜邦內(nèi)特的玻璃化技術(shù)使用相對(duì)容易，同時(shí)需要的樣本量較少；由于快速冷凍過程，生物分子在過程中凍結(jié)，研究人員拍攝一系列圖像，能夠捕捉到該進(jìn)程的不同部分。

通過這種方式，研究人員能夠制作出一段段的“影片”，記錄下蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，以及它們與其他分子之間相互作用的動(dòng)態(tài)過程。借助冷凍電鏡技術(shù)，分析細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得前所未有的容易，而這些蛋白質(zhì)往往與制藥技術(shù)緊密相關(guān)，對(duì)于超大型分子團(tuán)也是同樣如此。不過，小型蛋白質(zhì)仍然無法使用電子顯微鏡進(jìn)行研究，但它們可以借助傳統(tǒng)的X射線晶體學(xué)方法以及核磁成像技術(shù)進(jìn)行研究。約阿希姆?弗蘭克在1975年提出他的圖像算法之后，一名研究人員曾經(jīng)這樣寫道：“如果這種方法能夠被zui終完善，那么，用一位科學(xué)家的話來說，其前景將是一片坦途，無所阻礙?！?/span>

現(xiàn)在，海闊任魚躍，天高任鳥飛——雅克?杜邦內(nèi)特、約阿希姆?弗蘭克和理查德?亨德森所研發(fā)的這項(xiàng)技術(shù)將帶給人類zui大的益處。我們將能夠以原子層面的分辨率洞察細(xì)胞的每一個(gè)隱秘角落，生物化學(xué)將迎來一個(gè)光輝的未來！